01 uniprot

一般采用0.05mol/LTris-HCl,pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS),客户可根据样本及测定指标的情况自行设定浓度,目的是保持样本的等渗环境。

1、细胞沉淀的收集：

手工匀浆，超声破碎,裂解液裂解,反复冻融。

①手工匀浆：在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，用移液器将细胞悬浮液移至玻璃匀浆管中（2ml玻璃匀浆管），将玻璃匀浆管置于冰水混合物中，手动匀浆3分钟，然后取破碎好的细胞悬浮液进行测定。

②超声破碎:

在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，在冰水浴条件下进行如下操作:

a、用超声粉碎机进行粉碎，可用Soniprep150型超声波发生器以振幅14微米超声处理30秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用400安培，5秒/次，间隙10秒反复3～5次。

b、用超声细胞破碎仪，300W功率，每次超声3～5秒，间隔30秒，重复4～5次。

③裂解液裂解

常用裂解液有SDS、NP-40、TritonX-100,这三种去垢剂的作用是不同的，或者说作用力量强弱不同。

1、SDS属于离子型去垢剂，效果最强，基本可以把细胞核膜破坏掉，DNA会释放出来，裂解液变得很粘稠。

2、NP-40是很温和的去垢剂，1%浓度的基本可以破坏掉胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的buffer可以获得胞浆蛋白。

3、TritonX-100的能力介于NP40和SDS之间，偏向于NP40，也是常用的细胞裂解液成分之一，在保护蛋白活性方面有一定作用（SDS基本会使蛋白变性失活）。

去垢剂属性只是一方面，buffer、配比、浓度、提取方法和材料处理也都是关键因素

由于很多裂解液都是蛋白变性剂,对酶活力的测定有一定的影响,一般不推荐用裂解液进行裂解。

④反复冻融:

在细胞沉淀中加入一定量的PBS（PBS的加入量根据所测指标的不同而有所改变，一般加入0.5ml，细胞密度不小于一百万个/ml），混匀，将细胞悬浮于PBS中，放低温冰箱中结冰，溶解，再结冰，再溶解，反复3次左右）。由于反复冻融对酶活力影响较大，一般使用生化法测酶活时不能使用。